طرح ها و پروژه ها
عنوان طرح/پروژه: بررسی اثر اخلال گر هورمونی نونیل فنل بر تولید ویتلوژنین پلاسما و تغییرات سطوح IgM و لیزوزیم در ماهی کپور کوی
توضیحات:شماره مصوب: 91002-8919-12-12-014 واحد اجرا: مؤسسه تحقیقات علوم شیلاتی کشور محل اجرا: موسسه تخقیقات علوم شیلاتی کشور نام هماهنگ‌کننده/مجری مسئول/مجری: همایون حسین زاده صحافی سل شروع: 1394 سال خاتمه: 1395
متن:

اهمیت ، ضرورت ، اهداف و روش تحقیق:

پژوهش حاضر به بررسی تأثیر اختلالات آندوکرینی نونیل فنل اتوکسیلات بر تولید ویتلوژنین پلاسما و تغییرات سطوحIgMو لیزوزیم در ماهی کپور کوی (Cyprinuscarpio carpio) پرداخته است. بدین منظور ماهیان با میانگین وزنیگرم در غالب 6 تیمار (با دارابودن یک گروه کنترل الکلی- کنترل مثبت و یک گروه دریافت کننده 17 بتااسترادیول به عنوان گروه زنواستروژنیک به همراه 3 تکرار، در مدت 21 روز و به صورت تزریق درون صفاقی غلظت های 10، 50 و 100 میکروگرم بر گرم وزن بدن، نونیل فنل دریافت نمودند. گروه کنترل الکلی تنها محلول روغن نارگیل و اتانول دریافت نمودند، درحالیکه برای ماهیان گروهکنترلهیچ گونهتزریقی صورت نپذیرفت.در روز 22، ماهی ها به تعداد 10 قطعه در هر تیمار بیهوش و بیومتری ماهیان (اندازه گیری طول با استفاه از خط کش و وزن ماهی ها با استفاده از ترازوی دیجیتال با دقت 1/0 گرم انجام شد. پس از بیومتری، از ساقه دمی ماهی با استفاده از سرنگهپارینهازهر ماهی 1 سی سسی خونگیری شدو در میکروتیوب های هپارینه جمع آوری شد.میکروتیوب های حاوی خون ماهی به مدت 4-3 ساعت در یخچال ( ) قرار داده شدند و سپس به آزمایشگاه منتقل و به مدت 10 دقیقه درrpm 1500 سانتریفیوژ شدند. پلاسمای حاصل، جداشده و تا زمان سنجش شاخص های ایمنی (IgM، لایزوزیم) و ویتلوژنین کل پلاسما در فریزرنگه داری شدند.بهمنظور اندازه گیریمیزانایمونوگلوبینIgM (M) ازروشپیشنهادشدهSiwickiوAnderson در سال 1993استفاده گردید. روش اندازه گیری به این صورتاست کهIgM با آنتی بادی های پلی کلونال موجود درمحلول تشکیل کمپلکس داده و باعث کدر شدنمحلول می شود.میزان کدورت ایجاد شده با مقدارIgMرابطه مستقیم دارد. در این تحقیقIgM با استفاده از کیت شرکتBioscience و دستگاه اتوآنالایزر مدلEurolyser ساخت کشور اتریش اندازه‌گیری شدSiwicki,1993).( Anderson and

به منظور اندازه گیری سطوحلیزوزیماز روشتوصیه شدهEllisدر سال1990 استفادهگردید.اندازه گیری فعالیت آنزیم لیزوزیم به عنوان یکی از شاخص های ایمنی ذاتی با استفاده از سرم خون و روش جذب نوری به همراه سنجش کدورت صورت پذیرفت بدین منظور، در ابتدا 15 میکرولیتر همولنف با 135 میکرولیتر از سوسپانسیون 2/0 میلی‌گرم درمیلی‌لیتر باکتری میکروکوکوس لیزوداکتیکوس (سیگما) در بافر 02/0 مولار سدیم سیترات(8/5=pH) در گوده‌های میکروپلیتتخت 96 خانه¬ای الایزا مخلوط ¬گردید و جذب نوری آن در دمای اتاق در زمان‌های صفر و 6 دقیقه بعد از مخلوط‌سازی در طول موج 450 نانومتر اندازه‌گیری شد. میزان فعالیت لیزوزیم سرم با توجه به منحنی استاندارد مربوط به لیزوزیم سفیده تخم¬مرغ سیگما تعیین گردید (Ellis,1990).میزان ویتلوژنین در پلاسما توسط روش الایزا مورد آزمون قرارگرفت (Zhang et al., 2011).ابتدا حفره های پلیت 96 خانه ای توسط آنتی بادی اولیه (استخراج شده از خرگوش با رقت 5000: 1) یک شب گذرانی (12 ساعت) در 4 درجه سانتی گراد، پوشانده شدند. بعد از شستشو با محلول توئین 20، 1/0 درصد حاوی بافر نمکی فسفات، بافر بلوکه کننده شامل 200 میکرولیتر بافر نمکی فسفات حاوی 5/0 درصدBSA، اضافه شد. از کلیه نمونه های مورد تیمار قرار گرفته (نمونه پلاسما) یا آنتی ژن، 50 میکرولیتر در حفره ها بارگذاری شد تا به مدت 1 ساعت در دمای اتاق قرار گرفتند. بعد از 3 بار شتشو با بافر نمکی فسفات، واکنش با آنتی بادی ثانویهPeroxidase Conjugated AntiRabbit IgG به مدت 1 ساعت (در دمای اتاق) انجام شد. شستشو با بافر فسفات نمکی 3 بار تکرار شد و در انتها از 100 ماکرولیتر از مخلوط واکنش رنگی (تترا متیل بنزدین) روی خانه ها استفاده شد. این واکنش به مدت 1 ساعت در دمای اتاق ادامه یافت و با اضافه کردن 100 ماکرو لیتر اسید سولفوریک 1 نرمال متوقف شد. جذب واکنش در طول موج 492نانومتر توسطدستگاه خوانش الایزاتعیین شد.

نتایج:

. اثر استروژنیک 4- نونیل فنل به وسیله تحریک سنتز پیش ماده پروتئین های زرده ویتلوژنین در جنس نر و مادهنابالغماهی کپورکوی مشخص شد.سطحویتلوژنینپلاسما درجنسماده دریک رفتار وابستهبه دوز پس از تزریق شروعبه افزایش کرد ،به طوری که در غلظت های 10و 50میکروگرمبر گرمافزایش معنی داری دیده شد(05/0P<).اما بیشترین افزایش مربوط به غلظت 50میکروگرم برگرم (1± 58)بود(05/0P<). میزان پروتئین لایزوزیم در غلظت های 10 و 50 میکروگرم در گرم نونیل فنل در جنس ماده افزایش معنی داری در مقایسه با گروه کنترل داشت، ولی در تیمار 100 میکروگرم در گرم نونیل فنل کاهش معنی داری پیدا کرد (05/0p<). میزان لیزوزیم در تیمار 17-بتااسترادیول (2 میکروگرم در گرم) اختلاف معنی داری نسبت به تیمارهای نونیل فنل و گروه کنترل داشت. میزان ایمونوگلوبولین ام در غلظت های پایین و متوسط نونیل فنل 10 و 50 میکروگرم در گرم در جنس ماده به طور معنی داری نسبت به گروه کنترل افزایش پیدا کرد، ولی در غلظت بالای نونیل فنل( 100 میکروگرم در گرم )به طور معنی داری نسبت به گروه کنترل کاهش یافت (05/0p<) میزانIgM در تیمار 17-بتااسترادیول (2 میکروگرم در گرم) اختلاف معنی داری نسبت به تیمارهای نونیل فنل و گروه کنترل داشت. همچنین میزانIgM در گروه کنترل 1 (نمونه برداری در روز 21)، افزایش معنی داری در مقایسه با گروه کنترل صفر (نمونه برداری در ابتدای دوره) پیدا کرد (05/0p<). نتایج این تحقیق نشان داد، که نونیل فنل اتوکسیلات هم در غلظت های پایین و هم در غلظت های بالا اثرات قابل توجهی تولید ویتلوژنین پلاسما و تغییرات سطوحIgMو لیزوزیم داشته است.

دستورالعمل فنی و توصیه ترویجی:

-استفاده از شواهدی نظیر ویتلوژنین برای بررسی تاثیر پذیری آبزیان پرورشی از مخرب های هورمونی

-استفاده از شواهدی نظیر شاخص های ایمنی ماهیبرای بررسی تاثیر پذیری آبزیان پرورشی از مخرب های هورمونی

ویژگی مناطق کاربرد توصیه ترویجی:

تکثیر کنندگانماهیان گرم آبیدر نواحی محتلف اقلیم کشور و کلیه مراکز دانشگاهی و تحقیقاتی

سازمان حفاظت محیط زیست

تعداد بازدید:115
کلیه حقوق این سایت متعلق به موسسه تحقیقات علوم شیلاتی کشور می باشد

Designed by taJan System Co