طرح ها و پروژه ها
عنوان طرح/ پروژه:‌ تعیین خط شناسه مولکولی جلبک Microcystis aeruginosa (Kützing) Kützing 1846 دریاچه سد ارس با استفاده از ژن ITS-2
توضیحات:شماره مصوب یا کد پروژه: 93116-12-79-4 واحد اجرا: مرکز تحقیقات آرتمیای کشور محل اجرا: مرکز تحقیقات آرتمیای کشور- سد ارس نام مجری:فریدون محبی سال شروع:1393 خاتمه: 94/8/28
متن:

اهمیت و ضرورت:

یکی از مهمترین موجودات زنده در اکوسیستم های آبی فیتوپلانکتونها هستند. وجود فیتوپلانکتونها اغلب رشد، ظرفیت تولید مثل و خصوصیات جمعیتی سایر موجودات آبزی را تحت تاثیر قرار می دهد (Mohsenpour et al., 2010). تغییرات در اجتماعات فیتوپلانکتونی در یاچه های آب شیرین شاخص خوبی از حالت تروفی و کیفیت زیست محیطی سیستم محسوب می شود (Reynolds, 1996).

سیانوباکتریومMicrocystis aeruginosa گونه ای غالب در اجتماعات فیتوپلانکتونی آبهای شیرین محسوب می شود (Mur, 1983). زمانی که شرایط محیطی برای رشد این گونه مناسب باشد (دمای بالا و پایداری فیزیکی آب) شکوفایی آن رخ می دهد که این حالت در دریاچه سد ارس مشاهده می شود. یکی از دلایل عمده شکوفایی و رشد بیش از حد این گونه در دریاچه های پشت سدها افزایش جمعیت و ورود فاضلاب به آنها می باشد.بعبارت دیگر فعالیت انسانی باعث تخلیه مقادیر زیادی از مواد غذایی به داخل آب پشت سد ارس می‌گردد که رشد و تکثیر فیتوپلانکتونها را تحت تأثیر قرار داده و کیفیت و کمیت جمعیتهای آنها را دچار تغییر می‌نماید و یکی از عوامل بروز شکوفایی جلبکM.aeruginosa می باشد.سد ارس بر روی یکی از بزرگترین رودخانه های حوزه آبریز دریای خزر ساخته شده و از نظر شیلاتی، تامین آب آشامیدنی، تفریح و غیره اهمیت زیادی برای ساکنان منطقه دارد. شناخت اکوسیستم آن و شناسایی جمعیت های تشکیل دهنده میکروسیستیس می تواند مقدمه ای برای از بین بردن یا کاهش رشد بیش از حد این گونه سمی باشد.

اهداف و روش تحقیق:

اهداف طرح:

1-تعیین خط شناسه (بارکدینگ) جلبک میکروسیس تیس

2-ثبت ژنITS2 جلبک میکروسیس تیس در بانک ژن بین المللیncbi

در این مطالعه ابتدا پس از تعیین ایستگاههای نمونه برداری عملیات نمونه برداری به صورت فصلی آغاز خواهد شد. کار شناسایی و شمارش فیتوپلانکتونها بوسیله میکروسکوپ اینورتNikon TS100با روشUtermohl (1958) انجام خواهد شد. نمونه های جلبکMicrocystisدر فصلهای تابستان و پاییز برداشت خواهد شد. عوامل فیزیکی آب مثل دما،pH،DO، شفافیت،TDS، توسط دستگاه اکسی متر قابل حمل در حین نمونه برداری انجام خواهد شد. برای شناسایی مورفولوژیکی جلبک میکروسیستیس از کلیدهای شناسایی معتبرنظیرPrescott (1962),Tiffany and Britton (1971)Bellinger (1992) وSmith (1950)استفاده خواهد شد. برای بررسی جمعیت های جلبکMicrocystisعلاوه بر روشهای مورفولوژیکی از روش مولکولیITS2استفاده خواهد شد.

جهت بررسی مولکولی در هر ایستگاه حدود 100 لیتر آب از فیلتر 50 میکرونی عبور داده شده و در یک ظرف یک لیتری تغلیظ خواهد شد. در آزمایشگاه زیرنمونه های 100 میلی لیتری دوباره از فیلتر 100 میکرونی عبور داده شده و کلنی های میکروسیس تیس چندین با با آب شسته شده و در لوله های اپندورف غلیظ و در دمایc °25- نگهداری خواهند شد. برای خالص سازی جلبک میکروسیس تیس آنرا بر روی محیط کشت جامد آگار محتوی محیطBG-11استفاده می شود. استخراجDNAطبق پروتکلHumbert and Le Berre (2001) انجام خواهد شد. بطور خلاصه پس از سانتریفوژ کردن کلنی ها در 750 میکرولیتر بافر لیزکننده سلولی بمدت 1 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه خواهند شد. سپس 5 میلی گرم پروتئیناز اضافه و لوله ها در طول شب در دمای 40 درجه گذاشته خواهند شد. سپس استخراج با فنل-کلروفرم و رسوبدهی با اتانولDNAخالص بدست خواهد آمد.DNAاستخراج شده تا هنگام استفاده در دمایc°40- نگهداری خواهد شد. ژنITS2در هر نمونهDNAتوسطPCR(polymerase Chain Reaction)تکثیر می شود.L µ25از مخلوطPCRحاویng 60ازDNAالگو،Mµ 120از هر چهار نوکلئوتیدdNTP،10× بافر واکنشPCR ( mM 5/1 Mgcl2،mM50Kcl،mM 10 Tris-Hcl; pH 9)،mM 1از هر پرایمر (forward primer: 5¢-TGT AAA ACG ACG GCC AGT CCA TGG AAG YTG GTC AYG-3¢; reverse primer: 5¢-CCT CTG TGT GCC TAG GTA TCC-3¢), وU 5/1از آنزیمTaq DNAپلی مراز خواهد بود.DNAهای الگو و یک نمونه شاهد منفی در معرض یک مرحله اولیه دناتوراسیون بمدت 1 دقیقه در دمایC° 94قرار خواهد گرفت. 37 چرخه بعدی شامل یک مرحله 50 ثانیه ای دناتوراسیون در دمایC° 92، یک مرحله اتصال 50 ثانیه ای در دمایC° 57و یک مرحله تکثیر 50 ثانیه ای در دمایC° 72خواهد بود. یک مرحله نهایی تکثیر 10 دقیقه ای در دمایC° 72انجام خواهد گرفت. تکثیر نواحی هدف بوسیله آلکتروفورز روی ژل آگارز 5/1% رنگ آمیزی شده با ژل رد (Gel Red) مورد بررسی قرار خواهد گرفت. محصولاتPCRدر حاملPGEM-T (به نسبت 1:1 محصولاتPCRبه حاملها) کلون خواهند شد.

حداقل تعداد 10 کلنی به صورت تصادفی از هر مجموعه کلونها انتخاب و رشته هایITS2آنها بوسیلهPCRو با استفاده از پرایمرهایT7وSP6

T7 (5¢-TAC GAC TCA CTA TAG GGC GA-3¢) and SP6 (5¢-TAG GTG ACA CTA TAG AAT AC-3¢)

تکثیر خواهند شد. تکثیر نواحی هدف بوسیله الکتروفورز روی ژل آگارز 5/1% رنگ آمیزی شده با ژل رد مورد بررسی قرار خواهد گرفت. محصولاتPCRقبل از سکانسینگ خالص سازی خواهند شد. پس از انجام سکانسینگ، رشته هایDNAبطور مستقل در هر دو رشته انتخاب خواهند شد. جهت آنالیز بهتر تنها سکانس هایی انتخاب خواهند شد که 95%< تشابه با سکانس هایMicrocystis aeruginosa،M. wesenbergii،M. ichthyoblabeوM. viridisموجود در بانک ژن دارند. رشته های نوکلئوتید بدست آمده در بانک ژن کدگذاری و ثبت خواهد شد. همچنین داده های حاصل به روشهایNeighbor Joining (NJ)، حداکثر صرفه جویی و حداکثر احتمال با استفاده از نرم افزارPHYLIPمورد آنالیز قرار خواهد گرفت.

نتایج:

از تعدادی از نمونه های آب تهیه شده با شماره های 2، 3، 4، 5، 6، 11، 12، 15، 16، 18 نمونه هایی مشابه با مورفولوژی جلبکهای تک سلولیMicrocystis جدا شد. با توجه به سایز بسیار کوچک این جلبکها و احتمال اشتباه در شناسایی این جلبکها تکنیک مولکولی برای شناسایی آنها بکار رفت.

انجام الکتروفورز با استفاده از پرایمرهای اختصاصی سیانوفیسه توانست وجود جلبکهای سیانوفیسه در نمونه های ایزوله شده مورد تائید قرار دهد. در راستای بررسی تنوع نوکلئوتیدی باندهای حاصل ژل الکتروفورزDGGE انجام شد. همچنین به منظور تائید صحت باندهای حاصل از تکرارهای فوق تعیین توالی باندهای حاصل در 10 نمونه صورت پذیرفت. نتایج این بررسی نشان دهنده وجود 3 گونه از جلبکهای سیانوفیسه در بین نمونه ها بود که از نظر ژنتیکی اختلاف زیادی با گونه های شناخته شده در بانک ژنی بودند.

دستور العمل فنی و توصیه ترویجی:

1-بررسی سیانوتوکسین های (میکروسیستین) احتمالی موجود در آب دریاچه سد ارس

2-ثبت توالی های ژنی جدید در سایت بانک ژنیnbci

3-مطالعه شکوفایی جلبک میکروسیستیس در اکوسیستم های آب شیرین دیگر کشور

4-شناسایی تاکسونومیکی (مورفولوژیکی و مولکولی) جمعیت های میکروسیستیس در اکوسیستم های آب شیرین کشور

5-شناسایی گونه های میکروسیستیس از نظر تولید یا عدم تولید میکروسیستین دراکوسیستم های آب شیرین کشور

ویژگی مناطق کاربرد توصیه ترویجی:

دریاچه های پشت سدها که دارای آب شیرین بوده و کارایی هایی نظیر تامین آب آشامیدنی، کشاورزی، شیلات و تفریحی دارند و دراکثر مناطق کشور مخصوصا مناطق معتدله که دارای چهار فصل آب و هوایی مشخص و تناوب و توالی فصلی از نظر اجتماعات فیتوپلانکتونی قرار دارند.

تعداد بازدید:549
کلیه حقوق این سایت متعلق به موسسه تحقیقات علوم شیلاتی کشور می باشد

Designed by taJan System Co